WORD格式 RNA提取常见问题、原因分析及其对策 一、RNA提取的通用方法 异硫氰酸胍/苯酚法（即TriZol类试剂） 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出 来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从 而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 步骤: 材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70％乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。 二、影响RNA提取的因素 由于RNA样品易受环境因素特别是RNA酶的影响而降解，提取高质量的RNA样品在生命 科研中具有相当的挑战性。RNA提取对样品的新鲜性要求非常高，获取样品后最好立即提取 RNA，若无条件立即实验，应于-80℃或液氮中保存样品，提取时取出样品后立即在低温下研 磨裂解细胞，以防RNA降解。 1.材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料，如若材料来源困难，且实验需要一定的 时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次 提取，请分成多份保存，液氮长期保存，－70℃短期保存。 2.样品破碎及裂解： 根据不同材料选择不同的处理方法： 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对一些特殊的材料可先用酶或者机械方法 破壁 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻， 样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量 3.纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法， 如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；柱离心式纯化方法： 抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。 RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策 一、常见问题 1.RNA的降解2.OD260/OD280比值偏低3.电泳带型异常4.下游实验效果不佳 RNA的降解 （1）新鲜细胞或组织的RNA降解专业资料整理 WORD格式 RNA降解：1.裂解液的质量2.外源RNase的污染3.裂解液的 用量不足 4.组织裂解不充分5.另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的 降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 （2）冷冻样品的RNA降解 1.样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点； 2.先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 3.样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。 OD260/OD280比值偏低 （1）蛋白质污染；（2）苯酚残留；（3）抽提试剂残留；（4）设备限制。 电泳带型异常 （1）非变性电泳：上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导 致28S和18S条带分不开。 （2）变性电泳条带变淡：EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比 非变性电泳要淡一些； （3）甲醛的质量不高 下游实验效果不佳 （1）RNA降解；（2）抽提试剂的残留；（3）样品中杂质的残留；（4）DNA污 染。 专业资料整理 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/c2bf58fc75eeaeaad1f34693daef5ef7ba0d1220.html